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原理

EdU法細(xì)胞增殖成像分析試劑盒（綠色熒光）是一種替代BrdU的新型檢測(cè)方法。EdU（5-乙炔基-2′-脫氧尿苷）是胸腺嘧啶核苷的核苷類似物，可以在DNA合成過(guò)程中替代胸苷摻入到新合成的DNA中。與BrdU方法相比EdU-Click檢測(cè)不是基于抗體，因此不需要通過(guò)DNA變性（變性通常使用氯化氫、加熱或脫氧核糖核酸酶消化）來(lái)檢測(cè)加入的核苷。檢測(cè)基于Click反應(yīng)，疊氮化物和炔烴之間由銅催化的共價(jià)反應(yīng)，整個(gè)反應(yīng)30 min內(nèi)可完成。

自備耗材

·低溫離心機(jī)

·可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭

·去離子水

·固定液（含3.7%甲醛的PBS）

·通透劑（含0.5%Triton X-100的PBS）

試劑制備

EdU (10 mM)：即用型；使用前，平衡到室溫；-20℃保存。

BSA Wash Solution (1×)：向BSA Wash Solution（5×）中添加磷酸鹽緩沖液（PBS），將5×母液稀釋成1×工作液（終濃度為3% BSA），并混勻。使用后分裝并保存在-20℃，該溶液可穩(wěn)定保存6個(gè)月。

AbFluor 488Azide：即用型；使用前，平衡到室溫；-20℃避光保存。

ReactionBuffer (10×)：即用型，使用前，平衡到室溫；4℃保存。

Copper Reagent：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。

Reducing Agent (10×)的配制：向Reducing Agent中添加去離子水配制終濃度為100 mg/mL的Reducing Agent（10×）并混合直至化合物完全溶解。使用后分裝-20℃保存，該溶液可穩(wěn)定保存6個(gè)月。若溶液變成棕色，說(shuō)明組分已經(jīng)降解，不建議繼續(xù)使用。

Hoechst 33342 (1×)：臨用前配制，用PBS按1：1,000的比例配成1×Hoechst 33342工作液；分裝，-20℃避光保存。

Hydroxyurea：DNA合成抑制劑；即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。

實(shí)驗(yàn)步驟

A. EdU標(biāo)記培養(yǎng)細(xì)胞

本實(shí)驗(yàn)以96孔板培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞為例。懸浮細(xì)胞可在孵育EdU后進(jìn)行涂片處理（將適量細(xì)胞滴加到載玻片上，酒精燈烘烤至干燥），涂片后從固定開始與貼壁細(xì)胞采用相同的染色步驟。

1.孔板內(nèi)放入適配蓋玻片，接種適量細(xì)胞，使其生長(zhǎng)至所需密度后處理細(xì)胞；

2.可選步驟：陰性對(duì)照的設(shè)置：EdU孵育前加入DNA合成抑制劑Hydroxyurea，按1:1,000的比例直接加入到陰性對(duì)照孔內(nèi)，混勻孵育0.5h；

3.用10 mM EdU溶液在培養(yǎng)基中制備2×EdU工作溶液（20 ?M）。的EdU終濃度為10 ?M，用細(xì)胞培養(yǎng)液1:500稀釋10 mM EdU即可得到2×EdU工作溶液（20 ?M）；

4.將預(yù)熱（37℃）的2×EdU溶液等體積添加到含有試驗(yàn)細(xì)胞的培養(yǎng)基中，使96孔板中的EdU終濃度變?yōu)?×；

注意：建議不要更換所有培養(yǎng)基，因?yàn)檫@會(huì)影響細(xì)胞增殖速率；建議EdU起始濃度是10 ?M。

5.在*適合的條件下孵育細(xì)胞2 h（根據(jù)細(xì)胞擴(kuò)增時(shí)間確定，一般腫瘤細(xì)胞的孵育時(shí)間為2 h）；

6.孵育后除去培養(yǎng)基，并向每個(gè)孔中加入0.1 mL固定液（含3.7%甲醛的PBS），室溫下孵育15 min；

7.除去固定液，用0.1 mL BSA Wash Solution (1×)浸洗孔中細(xì)胞5 min，重復(fù)3次；

8.除去洗滌液，向每個(gè)孔中加入0.1 mL通透劑（含0.5%Triton X-100的PBS），室溫下孵育15 min；

9.除去通透劑，用0.1 mLBSA Wash Solution (1×)浸洗孔中細(xì)胞5 min，重復(fù)2次；

10.轉(zhuǎn)步驟C。

B. EdU標(biāo)記活體動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)以6周齡小鼠為例，其它動(dòng)物體內(nèi)EdU的標(biāo)記請(qǐng)參考相關(guān)文獻(xiàn)。

1. 對(duì)于小鼠，可以按照10-200 mg/kg的用量，把EdU用PBS配制成一定濃度，加入飲用水中。具體用量跟所用動(dòng)物的種類、體重和使用方式有關(guān)，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)，因此初次使用時(shí)建議對(duì)EdU的使用濃度進(jìn)行一定的摸索，或者直接使用50 mg/kg的濃度進(jìn)行測(cè)試。如果之前使用過(guò)BrdU進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。EdU需單獨(dú)購(gòu)買；

2.可選步驟：陰性對(duì)照的設(shè)置：EdU處理時(shí)加入DNA合成抑制劑Hydroxyurea，按1000 mg/kg的濃度用EdU溶液進(jìn)行配制。Hydroxyurea需單獨(dú)購(gòu)買；

3. 24小時(shí)后或根據(jù)特定實(shí)驗(yàn)確定的適當(dāng)時(shí)間后，快速處死小鼠，取出所需的組織，按照常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片。EdU標(biāo)記的時(shí)間也可以參考相關(guān)文獻(xiàn)自行調(diào)整；

4.對(duì)于冰凍切片：

(1) 加入適量固定液（含3.7%甲醛的PBS），室溫下孵育15 min；

(2) 除去固定液，用適量BSA Wash Solution (1×)浸洗5 min，重復(fù)3次；

(3) 除去洗滌液，加入適量通透劑（含0.5%Triton X-100的PBS），室溫孵育15 min；

(4) 除去通透劑，用適量BSA Wash Solution (1×)浸洗5 min，重復(fù)2次；

(5) 抗原修復(fù)(選做)：如果同時(shí)需要進(jìn)行目的蛋白的免疫熒光染色，并有必要進(jìn)行抗原修復(fù)，可以使用適當(dāng)?shù)目乖�修�?fù)液，或者自行配制的適當(dāng)?shù)目乖�修�?fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)處理；

(6) 轉(zhuǎn)步驟C。

5. 對(duì)于石蠟切片：

(1) 脫蠟：二甲苯中脫蠟5-10 min，換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10 min。組織復(fù)性：在無(wú)水乙醇中洗滌5 min，換新的無(wú)水乙醇洗滌3 min；然后依次在95%、85%、75%和50%乙醇中洗滌3 min；在PBS中洗滌5 min。

(2) 抗原修復(fù)(選做)：如果同時(shí)需要進(jìn)行目的蛋白的免疫組化染色，并有必要進(jìn)行抗原修復(fù)，可以使用適當(dāng)?shù)目乖�修�?fù)液，或者自行配制的適當(dāng)?shù)目乖�修�?fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)處理；

注意：如果使用蛋白酶K或胰酶進(jìn)行抗原修復(fù)，必須反復(fù)洗滌干凈，否則殘留的酶會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)標(biāo)記反應(yīng)。

(3) 轉(zhuǎn)步驟C。

C. EdU檢測(cè)

注意：在該步驟中，每孔使用100 ?L反應(yīng)混合物。對(duì)于其它孔板或切片，反應(yīng)混合物體積可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)節(jié)，但必須按比例加入反應(yīng)組分。

1.根據(jù)下表制備Click-iT反應(yīng)混合物；

注意：要按表中列出的順序添加成分，否則反應(yīng)將無(wú)法得到*佳效果。配置好的Click-iT反應(yīng)混合物必須在15 min內(nèi)使用。

2.向每個(gè)樣品中加入100?L Click-iT反應(yīng)混合物，室溫下避光孵育30 min；

3.除去反應(yīng)混合物，用0.1 mLBSA Wash Solution (1×)浸洗孔中細(xì)胞5 min，除去洗滌液；

4.可選步驟：進(jìn)行核染色（1×Hoechst 33342）或抗體標(biāo)記；

重要提示：在孵育過(guò)程中一定要避光。如不需要其它染色，孵育后請(qǐng)直接進(jìn)行成像和分析。

5.用熒光顯微鏡（Ex/Em =501/525 nm）分析樣品中標(biāo)記的DNA，用Ex/Em =360/460 nm檢測(cè)細(xì)胞核。

注意事項(xiàng)

1.為避免交叉污染，在加入不同樣本和不同試劑時(shí)都需更換吸頭。

2.實(shí)驗(yàn)開始前確保所有的組分及設(shè)備處于合適的溫度。

3.熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

4.為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

FAQ

1. 該試劑盒是否可以染間充質(zhì)干細(xì)胞，再進(jìn)行活體移植？

A: 建議先在體外培養(yǎng)觀察染色效果，再進(jìn)行移植實(shí)驗(yàn)，并在一周內(nèi)進(jìn)行顯色和觀察。

2. 該試劑盒可以做組織染色嗎？

A:  EdU適用于細(xì)胞增殖的檢測(cè)，如客戶想進(jìn)行組織染色，建議用增殖抗體PCNA（貨號(hào)ABP0112、A01040、ABP59848）及其直標(biāo)抗體進(jìn)行IHC實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

3. 該試劑盒是否可以用免疫熒光（IF）一起雙染？先后順序是怎樣的？

A: 可以和IF進(jìn)行雙染，建議行EdU染色標(biāo)記，再進(jìn)行IF染色。

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